免疫組化中常用的組織和細胞標本管理方法

    分析免疫組化，是應(yīng)用免疫學基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(shù)(immunocytochemistry)。常用的免疫組化組織和細胞樣本該怎么管理？
 (一) 石蠟切片
石蠟切片是制作組織標本zui常用、zui基本的方法 。
zui大優(yōu)點是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察； 
石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。 
石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改
善，因而它是大多數(shù)免疫組化中的組織標本制作方法。 
1.取材的特殊要求及注意事項 
*標本新鮮：一般在2h以內(nèi)進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原
或變性消失，或嚴重彌散。 
*取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。 
*-細胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。 
2.取材的特殊要求及注意事項(續(xù)) 
*避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因
而取材時應(yīng)使用鋒利的刀刃，鑷取組織動作要輕；經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有
過度擠壓，觀察結(jié)果時應(yīng)有所考慮。 
3.固定及常用的固定液 
*取材后的組織需立刻投于固定劑中 
固定使組織和細胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)；對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。 
*常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。 
-醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） 
-醇類（常用乙醇） 
-其它 （丙酮） 
(1) 醛類 
*甲醛(福爾馬林)應(yīng)用zui廣 
-原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 
-優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，組織收縮少。 
-缺點： 
*甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色； 
*醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出現(xiàn)空間障礙； 
*分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或*掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。 
-注意事項： 
C)，為此組織塊不宜過厚。?*縮短固定時間，降低固定溫度(4 
*改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.2～7.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10％甲醛固定液，減少固定液pH的變化。 
*固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。 
*切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復(fù))。

*戊二醛： 
-穿透性強，微細結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。 
*多聚甲醛(常用4%)： 
-可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。 
*主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細胞表面抗原，例如各類淋巴細胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。 
(2) 醇類 
* zui常用的醇類固定劑是乙醇。 
-其固定作用：使細胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 
-優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。 
-缺點： 
*脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。 
*乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。 
(3) 其它固定劑 
*丙酮： 
-對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用于組織標本，但細胞爬片常用丙酮固定。
 
(二) 冰凍切片
*冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接切片。 
*在切片前組織不經(jīng)過任何化學藥品處理或加熱過程。 
-縮短了制片時間 
-抗原性不受損失 
*對穩(wěn)定性差的抗原，如淋巴細胞表面抗原尤其適合。 
*組織凍結(jié)過程中，細胞內(nèi)、外的水分會形成冰晶，凍結(jié)的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴重影響組織、細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。 
1、冰凍組織塊的常用方法 
*液氮中冰凍：組織投入液氮中 (-196?C)10-20sec。
*干冰中加入丙酮(或異戊烷)，液體立即氣化起泡，溫度降至-70?C ，將組織投入，若在干冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好。 
-上述組織在速凍時應(yīng)浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi)，以保護組織。 
-制成凍塊后若需保存，應(yīng)以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存于-70?C冰箱。  
2、切片 
*供免疫組化用的冰凍切片同樣要求附貼平整，并有連續(xù)性。 
*載玻片也應(yīng)清潔無油污，但一般無需涂抹粘附劑； 
*切片時，使用恒溫冷凍切片機，在箱內(nèi)溫度-25?C，切片厚度一般為4～8?m 
3、切片后處理 
*切好的冰凍切片，室溫下自然晾干1～2h后，放入4?C丙酮固定10min，待干燥后作免疫組化染色或封存于-20℃。
*冰凍切片由于切片技術(shù)要求較高，不易得到連續(xù)性很好的切片，其形態(tài)結(jié)構(gòu)亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便于長期貯存，因此冰凍切片的應(yīng)用受限。

(三) 組織印片
*將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面，細胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定10min，自然干燥后染片或-20℃保存。

(四) 細胞培養(yǎng)片(細胞爬片)
*貼壁細胞培養(yǎng)，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細胞在蓋片上生長，達適當密度后取出固定(丙酮-20℃固定10～20min)，再進行免疫染色。
-蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。 
-為了防止細胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。

(五) 細胞涂片
*大多數(shù)細胞涂片由細胞懸液制成，包括： 
-血液、尿液、腦脊液； 
-體腔積液； 
-組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結(jié)或其他實質(zhì)性組織 
-懸浮培養(yǎng)的細胞或貼壁細胞經(jīng)消化后形成的懸液。