細(xì)胞凋亡與胰腺炎

摘要 從細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制來分析細(xì)胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系，并簡(jiǎn)要綜述實(shí)驗(yàn)性胰腺炎的凋亡誘導(dǎo)治療

　　近年的研究證實(shí)細(xì)胞凋亡參與胰腺炎的病理生理過程，但要從本質(zhì)上闡明細(xì)胞凋亡與胰腺炎之間的關(guān)系應(yīng)從細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制來進(jìn)行研究?，F(xiàn)在認(rèn)為細(xì)胞調(diào)亡參與胰腺炎發(fā)病主要有兩種機(jī)制：一類是受基因調(diào)控；另一類則是非基因調(diào)控。

　　1基因調(diào)控

　　受基因調(diào)控的細(xì)胞調(diào)亡又稱為程序性細(xì)胞死亡。一般分為兩類：一類是直接調(diào)控，如癌基因；另一類則是間接調(diào)控。如生物活性分子，通過誘導(dǎo)癌基因的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用。

　　癌基因中bc1-2基因家族是zui受關(guān)注的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因之一。Wada等[1]對(duì)胰管結(jié)扎（PDL）鼠應(yīng)用抗bc1-2單克隆抗體和抗增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體以免疫印跡和免疫組化方法對(duì)bc1-2和PCNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，PDL鼠胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的bc1-2表達(dá)在第四、五天高于對(duì)照組2~5倍。bc1-2和PCNA免疫染色在對(duì)照組的胰腺導(dǎo)管上皮為微弱的染色，而在PDL鼠胰腺導(dǎo)管皮bcl-2和PCNA免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增加，分別在第二天和第三天達(dá)zui高值。該結(jié)果表明，bc1-2具有抑制胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞凋亡的功能。為進(jìn)一步研究bc1-2基因家族中各基因的作用，Miyamoto等[2]研究PDL和雨蛙肽誘導(dǎo)急性胰腺炎兩種鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃腿寺宰枞砸认傺祝–OP）胰腺外分泌細(xì)胞bc1-2家族相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，在正常胰腺未見bc1-2基因家族表達(dá)；在PDL組胰管結(jié)扎后1天在胰腺細(xì)胞即觀察到bax和bc1-x表達(dá)，且在第二、三天尤為顯著，而其時(shí)胰腺腺細(xì)胞也發(fā)生凋亡。同時(shí)導(dǎo)管細(xì)胞增加形成導(dǎo)管管狀復(fù)合體，導(dǎo)管細(xì)胞內(nèi)bc1-2、bc1-x染色增加并在第五天達(dá)zui大值。鼠急性胰腺炎模型注射雨蛙肽后8小時(shí)和48小時(shí)發(fā)現(xiàn)胰腺細(xì)胞凋亡，同時(shí)應(yīng)用免疫組化方法觀察到胰腺細(xì)胞中存在 bax和bc1-x表達(dá)。COP時(shí)導(dǎo)管管狀復(fù)合體導(dǎo)管細(xì)胞bc1-2、bc1-x、mc1-1染色陽(yáng)性，但bax染色陰性。上述結(jié)果表明，在兩種鼠胰腺炎模型中胰腺細(xì)胞內(nèi)bax誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡；而bc1-2、mc1-1可能在防止導(dǎo)管細(xì)胞凋亡和形成導(dǎo)管管狀復(fù)合體中起作用；bc1-x有既可誘導(dǎo)又可抑制細(xì)胞凋亡的雙重作用。雖然許多實(shí)驗(yàn)證明bc1-2基因家族在胰腺細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制尚未*闡明。

　　癌基因中另一個(gè)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因是被稱為“基因組衛(wèi)士”的野生型p53。Maacke等[3]在行ERCP時(shí)收集了27例慢性胰腺炎病人胰液細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，并應(yīng)用一系列p53特異性單抗PAb1620、PAb1801、PAb240及CM-1（人重組p53多克降抗血清）以免疫過氧化酶染色觀察p53表達(dá)情況，同時(shí)以TUNEL法檢測(cè)調(diào)亡細(xì)胞。結(jié)果示，27例慢性胰腺炎病人中有16例（59%）p53蛋白表達(dá)陽(yáng)性，11例PAb1620表達(dá)陽(yáng)性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有凋亡細(xì)胞?？赡艿臋C(jī)制是慢性胰腺炎時(shí)氧自由基和一氧化氮基團(tuán)損傷DNA。p53表達(dá)增加可能是DNA損傷的結(jié)果，并在DNA損傷的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。有人認(rèn)為野生型p53提高細(xì)胞內(nèi)bax蛋白表達(dá)使得bc1-2/bax比例失衡而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。

　　在基因調(diào)控與細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究中，另一熱點(diǎn)課題是一些間接調(diào)控細(xì)胞凋亡的生物活性分子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）β、腫瘤壞死因子（TNF）等。zui近，Subramanian等[5]從源于人中胚層的成骨細(xì)胞中識(shí)別一種TGF-β調(diào)控的鋅指編碼基因的TIEG（TGF-β誘導(dǎo)的早期基因）與胰腺炎細(xì)胞凋亡有關(guān)。為進(jìn)一步研究TGF-β在胰腺外分泌細(xì)胞群中的表達(dá)、功能及其調(diào)控機(jī)制，Tachibana等[6]對(duì)培養(yǎng)的鼠胰腺AR42J細(xì)胞和人五種胰腺外分泌細(xì)胞PANC1、MIAPaCa2、BxPC3、HST66T和Capan1進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這六種外分泌細(xì)胞中均有豐富的TIEG mRNA表達(dá)。應(yīng)用純化的TIEG親和抗體進(jìn)行定位檢查發(fā)現(xiàn)TIEG存在于正常人胰腺外分泌部導(dǎo)管和腺細(xì)胞群。研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TGF-β處理上述細(xì)胞2小時(shí)后可見TIEG表達(dá)上調(diào)。為進(jìn)一步觀察TIEG的表達(dá)增加是否誘導(dǎo)胰腺外分泌細(xì)胞凋亡，用5ng/ml tGF-β1處理PANC1細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，結(jié)果顯示，在任一時(shí)間點(diǎn)TGF-β1都增加凋亡率，尤以72小時(shí)后為zui甚。為進(jìn)一步證實(shí)TIEG表達(dá)具有增加誘導(dǎo)凋亡功能，還進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。用10μg表達(dá)TIEG載體（pMEX-neo-TIEG）轉(zhuǎn)染PANC1細(xì)胞和僅轉(zhuǎn)染對(duì)照載體（pMEX-neo）的PANC1細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行研究。MTS增殖分析結(jié)果示，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和pMEX-neo細(xì)胞生長(zhǎng)正常；pMEX-neo-TIEG細(xì)胞增殖停止，而且72小時(shí)后pMEX-neo-TIEG細(xì)胞量較實(shí)驗(yàn)初低。DNA梯形圖譜分析表明，pMEX-neo-TIEG細(xì)胞凋亡數(shù)在任一時(shí)刻均超過30%，而且還發(fā)現(xiàn)pMEX-neo-TIEG細(xì)胞凋亡率比TGF-β1處理的PANC1細(xì)胞凋亡率高，這可能是觀察到的TGF-β1處理的PANC1細(xì)胞TIEG上調(diào)是瞬時(shí)的，而pMEX-neo-TIEG細(xì)胞內(nèi)的TIEG上調(diào)則是穩(wěn)定的。因此，TGF-β誘導(dǎo)的TIEG表達(dá)增加可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

　　還有一些資料表明，TNF是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的介質(zhì)[7]，可能的機(jī)制是TNF激活T細(xì)胞表達(dá)Fas配體，F(xiàn)as配體再與靶細(xì)胞結(jié)合促使靶細(xì)胞凋亡。

　　不僅TGF-β、TNF這些因子通過誘導(dǎo)癌基因表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，而且一些生物活性物質(zhì)也有類似的機(jī)制。有學(xué)者報(bào)道，用維生素K3和超過生理濃度的雨蛙肽（＞10-10M）[8]和用低濃度peroxynitrite（2~5μM）[9]分別培養(yǎng)鼠胰腺AR42J細(xì)胞，結(jié)果均可觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，且發(fā)現(xiàn)野生型p53表達(dá)增加。上述結(jié)果表明，一些生物活性物質(zhì)可能通過野生型p53表達(dá)增加誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

　　2非基因調(diào)控

　　近年來，盡管有關(guān)蛋白質(zhì)和RNA合成抑制劑抑制凋亡研究已證實(shí)蛋白質(zhì)大分子合成是凋亡的另一重要生化特征，同時(shí)證實(shí)細(xì)胞凋亡是一種由內(nèi)在基因編碼調(diào)控的細(xì)胞死亡方式[10]。但也有Fas介導(dǎo)細(xì)胞凋亡不依賴蛋白質(zhì)合成的報(bào)道[11]。一些損傷因子直接或間接損傷DNA而致細(xì)胞凋亡，如缺血再灌注等。這些現(xiàn)象表明凋亡除受基因調(diào)控外還受非基因調(diào)控。

　　Fujimoto等[12]用血管鉗鉗夾鼠胰腺下方的脾動(dòng)脈1小時(shí)后再松開血管鉗造成選擇性胰尾部缺血再灌注的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，然后用DNA凝膠電泳方法觀察細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果在缺血再灌注后48小時(shí)觀察到胰腺細(xì)胞凋亡的典型DNA梯形圖譜。該實(shí)驗(yàn)表明，缺血再灌注可誘導(dǎo)胰腺細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制尚不太清楚。

　　盡管從凋亡的分子機(jī)制研究凋亡與胰腺炎關(guān)系取得了一些進(jìn)展，但仍需進(jìn)一步闡明凋亡在胰腺炎中的確切作用機(jī)制，從而使之應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

　　新近，Matsuzaki等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在雨蛙肽誘導(dǎo)的急性胰腺炎的急性階段很少觀察到細(xì)胞凋亡，但在急性期后恢復(fù)階段則見大量細(xì)胞凋亡。而Tanaka等[14]研究觀察到，在不同的慢性胰腺炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示凋亡的顯著性。這些結(jié)果表明，細(xì)胞凋亡可能是胰腺炎病理生理中的一個(gè)環(huán)節(jié)，可能使胰腺炎向好的方向發(fā)展，亦可能使病情惡化。

　　3實(shí)驗(yàn)性胰腺炎的凋亡誘導(dǎo)治療

　　Kaiser等[15]報(bào)道，在五種急性胰腺炎模型中急性胰腺炎嚴(yán)重程度與凋亡呈負(fù)相關(guān)現(xiàn)象，即在阻塞鼠膽胰共同通路和輸注大劑量雨蛙肽誘導(dǎo)的輕度胰腺炎中可觀察到細(xì)胞凋亡，而在阻塞負(fù)鼠膽胰共同通路和年幼雌鼠CDE飲食（無(wú)膽堿而乙硫氨酸充足的食物）誘導(dǎo)的重癥胰腺炎則觀察到壞死。凋亡與胰腺炎嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，表明細(xì)胞凋亡可能是對(duì)胰腺損傷的有利反應(yīng)。zui近有研究提出，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度。Saluja等[16]報(bào)道，在細(xì)胞凋亡存在條件下可減輕雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。給予實(shí)驗(yàn)鼠5周大豆飲食后轉(zhuǎn)為正常飲食27小時(shí)，然后重復(fù)注射超大劑量雨蛙肽50μg·kg-1·h-1共12小時(shí)誘導(dǎo)胰腺炎，對(duì)照組給予5周正常飲食后注射同樣劑量的雨蛙肽誘導(dǎo)胰腺炎。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在5周大豆飲食繼而轉(zhuǎn)為正常飲食后，原來肥大的胰腺腺體迅速縮小，并且觀察到縮小期間伴有大量的腺細(xì)胞凋亡，在縮小期間注射雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎炎癥程度為2+，而對(duì)照組炎癥為4+（4+表示廣泛的炎癥，0表達(dá)無(wú)炎癥）。結(jié)果表明，在腺細(xì)胞凋亡時(shí)注射雨蛙肽，可減輕其誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。為進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，Kaiser等[10]在結(jié)扎鼠膽胰共同通路誘導(dǎo)胰腺炎后給予蛋白質(zhì)合成抑制劑環(huán)已酰亞胺以抑制細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡后加重胰腺炎病變程度。另外一些學(xué)者用實(shí)驗(yàn)證明DA-9601[17]和1-cyano-2-hydroxy-3-butene（CHB）[18]誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也減輕了雨蛙肽誘導(dǎo)的胰腺炎嚴(yán)重程度。

　　由此可見，誘導(dǎo)調(diào)亡可能會(huì)降低胰腺炎的嚴(yán)重程度。盡管這些研究于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，但仍顯示出細(xì)胞凋亡用于胰腺炎臨床實(shí)踐的美好前景。相信隨著細(xì)胞凋亡的繼續(xù)深入研究，必將有助于揭示胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，并有可能提高胰腺炎的診療水平。