分光光度法測定葉綠素含量

一、實驗目的
　　1.了解植物組織中葉綠素的分布及性質。
　　2.掌握測定葉綠素含量的原理和方法。

　　二、實驗原理
　　葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細胞中與蛋白質結合成葉綠體。當植物細胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對光、熱較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。

　　葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：
　　1.原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進而間接計算葉綠素的含量。
　　2.分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在zui大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計算出提取液中各色素的含量。

　　葉綠素a 和葉綠素b 在645nm 和663nm 處有zui大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm 波長下的吸光值，并根據(jù)經(jīng)驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素的含量。

　　三、儀器、原料和試劑

　　儀器：分光光度計、電子頂載天平（感量0．01g）、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管。
　　原料：新鮮（或烘干）的植物葉片
　　試劑：1. 96％乙醇（或80％丙酮）；2. 石英砂；3. 碳酸鈣粉

　　四、操作步驟
　　取新鮮植物葉片（或其它綠色組織）或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。

　　取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數(shù)次，zui后連同殘渣一起倒入漏斗中。

　　用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。zui后用乙醇定容至100mL，搖勻。
取葉綠體色素提取液在波長665nm、645nm 和652nm 下測定吸光度，以95％乙醇為空白對照。

　　五、計算
　　按照實驗原理中提供的經(jīng)驗公式，分別計算植物材料中葉綠素a、b 和總葉綠素的含量。