基因克隆的幾種常用方法

1　根據(jù)已知序列克隆基因
　　
　　對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中zui為簡(jiǎn)便的一種。獲取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)?，F(xiàn)在上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫中的注冊(cè)號(hào)（accession　number）,以便別人參考和查詢。目前,世界上主要的基因庫有:（1）EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫,其網(wǎng)上地址為http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;（2）Genbank,為設(shè)在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）的基因庫,其網(wǎng)上地址為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html;（3）Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫,其所含序列的準(zhǔn)確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。目前,以Genbank的應(yīng)用zui頻繁。這些基因庫是相互的,在Genbank注冊(cè)的基因序列,也可能在Swissport注冊(cè)。要克隆某個(gè)基因可首先通過Internet查詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫中注存。查詢所有基因文庫都是免費(fèi)的,因而極易將所感興趣的基因從庫中拿出來,根據(jù)整個(gè)基因序列設(shè)計(jì)特異的引物,通過PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物種和分離株之間的差異,為了保證PCR擴(kuò)增的準(zhǔn)確性,有必要采用兩步擴(kuò)增法,即nested PCR。
　　
　　根據(jù)蛋白質(zhì)序列也可以將編碼該蛋白質(zhì)的基因擴(kuò)增出來。在基因文庫中注冊(cè)的蛋白質(zhì)序列都可以找到相應(yīng)的DNA或cDNA序列。如蛋白質(zhì)序列是自己測(cè)定的,那么需要設(shè)計(jì)至少1對(duì)簡(jiǎn)并引物（degenerated primer）,從cDNA文庫中克隆該基因。以這種方法克隆的基因必須做序列測(cè)定才能鑒別所擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
　　
　　另外,在基因克隆之后,如還要進(jìn)一步做表達(dá)研究,所使用的PCR酶不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我檢測(cè)（reading proof）功能的酶,如pfu。這樣可以避免由于擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的點(diǎn)突變或終止密碼子而導(dǎo)致整個(gè)研究結(jié)論的錯(cuò)誤。

　　2　根據(jù)已知探針克隆基因
　　
　　這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標(biāo)記,再將其與用不同內(nèi)切酶處理的基因組DNA雜交,zui后將所識(shí)別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒）中作序列測(cè)定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來,還能同時(shí)觀察該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在探針雜交后,要注意高強(qiáng)度（high　stringent）漂洗,以避免干擾信號(hào),即保證克隆的特異性,同時(shí)節(jié)省時(shí)間。

　　3　未知序列的基因打靶
　　
　　根據(jù)已知序列進(jìn)行基因克隆,多數(shù)是重復(fù)別人的工作,或者是在別人工作的基礎(chǔ)上繼續(xù)自己的工作,因而不存在新基因的克隆過程。對(duì)未知序列的基因克隆才是真正的創(chuàng)造性研究。

　　3．1　隨機(jī)引物法克隆未知序列基因　　
　　隨機(jī)引物PCR（arbitrarily　primed　PCR,AP-PCR）首先被用于基因組DNA或RNA的指紋圖譜（finger　print）分析,后來也有人將這種方法用于克隆與表型相關(guān)的基因或mRNA。該方法的理論依據(jù)是:表型受基因支配,在一個(gè)生物體發(fā)生了表型變化后,其基因組DNA很可能發(fā)生變化或出現(xiàn)不同基因的激活或關(guān)閉等;另一方面,如在寄生蟲的發(fā)育過程中,不同發(fā)育階段的蟲體所表達(dá)的基因很可能不同,如將不同發(fā)育階段的蟲體mRNA提取出來,用單一引物（隨機(jī)引物,其長(zhǎng)度不超過16 nt）對(duì)不同時(shí)期的蟲體mRNA進(jìn)行擴(kuò)增比較,即可找出導(dǎo)致表型變異的遺傳學(xué)依據(jù)。這種方法是一種比較PCR,它要求至少有2種來自不同表型但又很類似的基因組DNA或mRNA。AP-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物必須99%是一致的,只有個(gè)別特異的產(chǎn)物出現(xiàn)在特異的表型個(gè)體中。該方法對(duì)表型或種源關(guān)系相差甚遠(yuǎn)的生物個(gè)體之間沒有比較意義（見圖1）。

圖1　應(yīng)用AP-PCR法進(jìn)行2種或多種表型特征類似的個(gè)體間指紋圖譜分析或表型相關(guān)基因克隆　箭頭所指擴(kuò)增帶為特異于個(gè)體（Ⅱ）的擴(kuò)增產(chǎn)物

　　AP-PCR的操作一般采用兩步法,即*個(gè)循環(huán)多以較低的退火溫度（annealing　temperature）進(jìn)行擴(kuò)增,后20個(gè)循環(huán)則采用較高的退火溫度擴(kuò)增。AP-PCR產(chǎn)物多較短,一般需高濃度的瓊脂糖凝膠檢測(cè),也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。如擴(kuò)增的模板為mRNA,通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度,可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發(fā)育階段的表達(dá)強(qiáng)度。另外,在AP-PCR檢測(cè)到與某一表型相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物（mRNA）以后,下一步工作就是克隆出整個(gè)基因或mRNA。主要操作程序?yàn)?（1）AP-PCR產(chǎn)物的提取、克隆及序列測(cè)定。首先將AP-PCR檢測(cè)到的特定片段從凝膠中切下,提取DNA克隆到適宜的載體內(nèi)（如TA載體）,再測(cè)定其核苷酸組成。根據(jù)其核苷酸組成設(shè)計(jì)2個(gè)方向相反的引物（P-1,P-2,見圖2）。引物長(zhǎng)度多在20 nt以上；退火溫度在60℃以上；（2）將基因組DNA做適當(dāng)酶切,然后在其兩端連接上相同的接頭（見圖2,這種接頭可從生物制品公司購(gòu)買）。根據(jù)接頭的序列擴(kuò)增。

　　3.2　Differential　display　PCR（DD-PCR）　
　　DD-PCR是在AP-PCR基礎(chǔ)上發(fā)明的一種RT-PCR方法,主要用于2種或多種類似生物個(gè)體在基因表達(dá)上的差異分析。其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同長(zhǎng)度的poly+（A）尾部序列,根據(jù)poly+（A）內(nèi)部的2個(gè)核苷酸排列的不同,可以將所有的mRNA分子分為12類（見圖3）。

圖３真核生物12種mRNA的序列特點(diǎn)

圖４DD-PCR示意圖　箭頭所示為特異擴(kuò)增產(chǎn)物

　　根據(jù)這12種mRNA序列可合成12種相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物，即M’N’TTTTTTTT……,用其分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,即可將所有mRNA分類合成12種cDNA（于12個(gè)試管內(nèi)），然后再用隨機(jī)引物,以這12種cDNA分別做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增（見圖1和圖4），那么與表型相關(guān)的mRNA就很容易被發(fā)現(xiàn)并克隆出來。但不論AP-PCR還是DD-PCR,都適用于2種種源近似生物或不同發(fā)育階段的同一個(gè)體之間的比較。因而,其PCR的模板必須是來自2個(gè)生物或同一生物的不同發(fā)育階段的mRNA。DD-PCR的優(yōu)點(diǎn)是快速、方便,可以檢測(cè)表達(dá)量極低的mRNA，但其技術(shù)條件要求較高，所擴(kuò)增的mRNA的質(zhì)量不能有差異,即mRNA不應(yīng)降解。目前這一方法已廣泛應(yīng)用于生物表型相關(guān)基因的克隆及比較研究。

　　3.3　Representative　difference　analysis　PCR （RDA-PCR）
　　這是一種差減雜交 （subtractive　hybridizatio-n）與PCR相結(jié)合的技術(shù)，其整個(gè)操作程序*不同于AP-PCR和DD-PCR。前2種方法是將兩模板DNA或cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,zui后通過擴(kuò)增產(chǎn)物的差異,分離和克隆特異擴(kuò)增帶,其缺點(diǎn)是需要將特異擴(kuò)增產(chǎn)物從膠中切下來,提取DNA,再擴(kuò)增后才能克隆。RDA-PCR只擴(kuò)增區(qū)別于某一表型的特異基因，因而更便于擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與分析（見圖5）。

　　其基本原理是：用一個(gè)在種源上相近的基因組將靶基因組中所有共同的基因掩蓋起來,而只暴露出特異的基因,在整個(gè)反應(yīng)中只有特異基因能被擴(kuò)增。其操作程序?yàn)?（1）用同一限制性內(nèi)切酶（一般用Bam HI,Bgl II或Hind III）同時(shí)處理靶基因組和掩蓋基因組DNA，其中掩蓋基因組DNA的量至少要2倍于靶基因組DNA的量；（2）在經(jīng)酶切的靶基因組片段的兩端加上連接頭,其序列與酶切產(chǎn)生的粘性末端的序列相對(duì)應(yīng)；（3）將2個(gè)基因組的DNA混合后,高溫變性,低溫退火。由于掩蓋基因組DNA的量遠(yuǎn)大于靶基因組DNA量,那么與掩蓋基因組DNA相同的靶基因就會(huì)與掩蓋基因形成雜合體，而只有特異的靶基因才能重新組合,不會(huì)受掩蓋基因的影響；（4）用Taq DNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)齊后,加入與連接子相對(duì)應(yīng)的引物,經(jīng)過30個(gè)左右的PCR擴(kuò)增,就可以將靶基因組中與掩蓋基因不同的特異基因擴(kuò)增出來。這種方法的起始操作程序較復(fù)雜,各反應(yīng)步驟要求準(zhǔn)確無誤,但其檢測(cè)的準(zhǔn)確度較高。對(duì)于基因組內(nèi)的點(diǎn)突變、重排、插入序列等變化均可檢測(cè)出來。

　　4　用特異抗體克隆基因
　
　　用抗體克隆基因的關(guān)鍵是抗體的特異性。一般以單克隆抗體zui為理想。獲取特異抗體的方法主要有:（1）制備識(shí)別功能抗原的單克隆抗體;（2）將SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)特異帶切下免疫動(dòng)物,其抗體只識(shí)別該特異蛋白質(zhì);（3）用Western-blot法將識(shí)別某一蛋白質(zhì)帶的抗體從膜上洗脫下來。在獲取理想的抗體后,便可以用這些抗體篩選表達(dá)型基因組文庫或cDNA文庫,從文庫中將編碼某一特異蛋白質(zhì)的基因克隆出來。

　　5　特異基因的功能克隆
　　它是借助于基因產(chǎn)物即基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能將該基因克隆出來的一種方法?；虻墓δ芸寺≈饕?種:一是phage　display,另一是peptide　display。后者的原理與前者基本相同。目前以phage　display的應(yīng)用,本文只對(duì)這一方法加以介紹。
　　
　　任何一種病原體，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲,在其對(duì)宿主侵入或致病過程中,病原體本身的蛋白質(zhì)成分（ligand）需要首先與宿主細(xì)胞上的受體（receptor）相互識(shí)別連接。如口蹄疫病毒需要借助于受體細(xì)胞上的Heparan　sulfate受體，并與其相互作用后才能侵入細(xì)胞內(nèi)；巴貝斯蟲裂殖子需借助于宿主的補(bǔ)體作為橋梁，才能與紅細(xì)胞結(jié)合并zui后侵入紅細(xì)胞內(nèi)。對(duì)病原體與宿主受體相互作用成分的特性與功能分析,是制訂免疫預(yù)防措施及制備阻斷藥物的前提。phage　display法是克隆病原體ligand的一種zui為理想的手段。

圖6　phage display克隆基因示意圖

　　Phage　display的基本操作過程為:（1）提取某一病原體基因組DNA,用超聲波將DNA切割成500～1 500的片段;（2）將片段末端用T4DNA聚合酶處理后,與載體DNA（phagemid）連接形成噬菌體質(zhì)粒。用這些質(zhì)粒與輔助噬菌體（helper　phage）同時(shí)轉(zhuǎn)染大腸桿菌。phagemid在大腸桿菌內(nèi)包裝成噬菌體,大量繁殖,同時(shí)將插入的外源基因片段表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要集中在噬菌體顆粒的表面；（3）將特定的受體固定于載體上（多為ELISA板）,方法同一般的ELISA包被。將噬菌體懸液作適當(dāng)稀釋后,加入平板孔內(nèi),感作一段時(shí)間,用PBS等緩沖液漂洗。zui后,只有表達(dá)特異功能蛋白的噬菌體才能與包被在平板上的受體相互結(jié)合,那些表達(dá)非相關(guān)蛋白的噬菌體由于不能與受體連接而被洗脫;（4）用高強(qiáng)度NaCl液將結(jié)合在受體上的噬菌體分離下來,再感染大腸桿菌,便可將編碼特異功能蛋白質(zhì)的基因克隆。

　　一個(gè)真核生物至少含有10萬個(gè)不同的基因,其中只有10%～15%的基因在不同的發(fā)育時(shí)期表達(dá),且不同的基因表達(dá)的強(qiáng)度相差甚遠(yuǎn)。在致病生物中,致病力強(qiáng)的生物,其致病因子（往往是1種或幾種功能蛋白或酶）的表達(dá)量往往多于致病力弱的生物。從基因組中將人們感興趣的基因或其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴(kuò)增并克隆出來,是進(jìn)一步對(duì)所編碼蛋白質(zhì)作功能分析的關(guān)鍵。本文介紹的幾種基因克隆的方法是近幾年應(yīng)用比較廣泛的方法。在具體實(shí)驗(yàn)中選擇哪一種方法,還要根據(jù)研究者所要克隆的基因及其所在的基因組和對(duì)該基因的研究背景來決定。