核酸提取、PCR、熒光定量PCR常見問題解答

*部分 核酸DNA和RNA提取常見問題分析

1.       RNAfixer的工作原理？

浸入組織，抑制RNase的活性。運(yùn)輸方便，是非液氮類的一種樣品儲(chǔ)存液。

2.       對(duì)于內(nèi)源RNase豐富的組織和樣品，如何消除RNase？

可以在提取時(shí)候多加裂解液，比如4：1等。

3.       TRIpure and RNApure區(qū)別？

胍鹽類的裂解液一樣，RNApure附加有離心柱，和漂洗液，是Kit。

TRIpure只是裂解液。

4.       凝血的gDNA和RNA的提取與新鮮血的提取不同？

需加一個(gè)分離柱（separate column）分開凝血。

5.       microRNA提取和定量？

過2次離心柱，得到200bp一下的小RNA。可以測(cè)定OD定量。

6.       血清，血漿，血液RNA提取的區(qū)別？以及Viral RNA提取的方法？

液體類樣品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血漿是無細(xì)胞樣品，含游離的RNA，量比較少，建議加Carrier RNA在提取時(shí)候。

病毒RNA提取加Carrier RNA在提取時(shí)候，BioTeke有專門的病毒RNA提取試劑盒。

7.       通用植物RNA提取常見問題：蛋白質(zhì)污染？

DNA污染-DNaseI消化（Kit does not provide it, please get it from other companies.）

8.       真菌RNA提取

可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

9.       DNA cleanup from gel and PCR, 區(qū)別？

膠回收含有一個(gè)溶膠液。多功能膠回收可以用于膠回收和PCR產(chǎn)物回收。

10.    土壤DNA提取優(yōu)點(diǎn)？

無需要機(jī)械破碎樣品和過柱的純化方式，減少DNA的鍛煉和得率，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

第二部分PCR/RT-PCR常見問題解答

1.     二次PCR無目標(biāo)產(chǎn)物，電泳孔道亮？

Template稀釋和重新設(shè)計(jì)引物

2.     microRNA的反轉(zhuǎn)錄問題？

microRNA反轉(zhuǎn)錄和普通的mRNA的反轉(zhuǎn)錄不一樣?，F(xiàn)在常見的microRNA反轉(zhuǎn)錄引物有2種，一個(gè)是step-loop結(jié)構(gòu)；另外一種是3末端加polyA后，再用oligo（dT）逆轉(zhuǎn)錄。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

3.     cDNA的合成（RT）電泳，以及cDNA第二鏈的合成問題？

2-5uLcDNA產(chǎn)物電泳有模糊條帶出現(xiàn)。第二鏈合成也有專門的試劑盒。BioTeke現(xiàn)在沒有此類產(chǎn)品。

4.     Power Mix擴(kuò)增不成功因素？

產(chǎn)品或者引物或者目的基因的不表達(dá)。

5.     RT-PCR沒有擴(kuò)增產(chǎn)物?

可能是引物，模版，產(chǎn)品等。

第三部分Real-time qPCR 常見問題分析

1.     做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)候，可否用2個(gè)不同體系濃度的稀釋分別對(duì)于內(nèi)參和目的基因？

建議用同樣稀釋倍數(shù)做曲線，因?yàn)槟０鍧舛葧?huì)影響擴(kuò)增效率。

2.     熔解曲線中，Tm不出現(xiàn)在80度左右？

擴(kuò)增片段100bp左右的，一般應(yīng)該出現(xiàn)在80度左右。如果低于此溫度出現(xiàn)，可能是模板降解。

3.     擴(kuò)增曲線沒有Ct值，僅僅一條斜線？什么原因？

模板濃度過低或者模板降解。

4.     如果內(nèi)參和目標(biāo)基因表達(dá)量差別比較大，也就是目的基因的表達(dá)量少，

   Ctcon=15，Cttarget=38，可否應(yīng)用？

可以用于數(shù)據(jù)分析。因?yàn)楸磉_(dá)量低，從而用過高模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而同內(nèi)標(biāo)的模板不同，反而會(huì)增大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的誤差。

5.     引物濃度可否是50nM，是否太低？

如果擴(kuò)增曲線和熔解曲線比較好，這個(gè)濃度當(dāng)然可以。如果更低，擴(kuò)增結(jié)果好的情況下，同樣可以運(yùn)用。

一句話，所有的模板、引物等濃度盡量不要用高的，會(huì)影響擴(kuò)增效率。

6.     miRNA多個(gè)擴(kuò)增時(shí)候，如果一個(gè)的擴(kuò)增效果比較，其它熔解曲線不止一個(gè)峰，如何解決？

Primer對(duì)于miRNA是專一的。所以重新設(shè)計(jì)引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更換mastermix等。反應(yīng)體系會(huì)影響反應(yīng)產(chǎn)物的。

7.     相對(duì)定量方法，如果用Ct值比較，是各個(gè)樣品平均后在2delt Ct還是分別2 delt Ct在平均比較好？

相對(duì)定量的方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，主要取決于實(shí)驗(yàn)的目的和材料的準(zhǔn)備。如果是材料群體個(gè)體差異不大，這2種方法基本沒有很大的區(qū)別；如果是個(gè)體差異比較大，建議用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線做。就是分別做內(nèi)參和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別帶入Ct值計(jì)算。

8.     熔解程序可否不加？

如果是擴(kuò)增效果好，特異擴(kuò)增，可以不加熔解程序；但建議做好加上。

9.     擴(kuò)增反應(yīng)體系5uL，擴(kuò)增效率低，什么原因？

反應(yīng)體系小，各種因素的影響比較大，比如引物濃度、模板濃度及其金屬離子等會(huì)影響擴(kuò)增效率的。

10.  如何減少非特異性擴(kuò)增的干擾？

設(shè)計(jì)一對(duì)好引物，提高primer的退火溫度，以及設(shè)定吸光溫度。